• 1. Extraction saline d’ADN
  • 2. Séparation lymphocytes
  • 3. Lignées lymphoblastoïdes - Immortalisation
1. Centrifuger les tubes de sang à 2400 rpm / min à température ambiante pendant 15 min.
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2. Récupérer le plasma sous hotte PSM et le transférer dans une ampoule de cryoconservation placée ensuite au -80° C.
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3. Diluer avec 1 volume de solution tampon (RPMI) à température ambiante pour 1 volume de sang (-plasma) puis transférer dans 1 tube de 10 ml prérempli avec 3 ml de Ficoll.
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4. Centrifuger 10 min à 1000 G à température ambiante après avoir désactivé le frein.
5. Après la centrifugation, obtention d’un anneau lymphocytaire.
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6. Transférer la fraction comprenant l’anneau lymphocytaire par inversion (tube avec membranne) dans un tube de 15 ml pré-rempli avec 7 ml de PBS 1x.
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7. Centrifuger à 250 G pendant 10 min à température ambiante.
8. Eliminer le surnageant puis reprendre le culot avec 10 ml de PBS 1 x – homogénéiser délicatement par allers/retours.
9. Prélever 10 µl de l’homogénat pour établir une numération des lymphocytes avec une évaluation de la viabilité (bleu trypan).
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10. Centrifuger à 250 G pendant 10 min à température ambiante.