• 1. Extraction saline d’ADN
  • 2. Séparation lymphocytes
  • 3. Lignées lymphoblastoïdes - Immortalisation
1. Décongeler les ampoules de PBL (conservées à -150° C) au bain–marie.
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2. Sous hotte PSM: Transférer le contenu d’une ampoule décongelée dans un tube 15 ml pré rempli avec 2 ml de milieu complet (20% de sérum de veau fœtal).
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3. Laisser 10 minutes à température ambiante puis ajouter 5 ml de milieu complet-20%SVF avant de centrifuger 5 min à 1200 trs/min.
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4. Eliminer le surnageant puis reprendre le culot avec 3 ml de milieu complet -20%SVF.
5. Laisser 1 heure sous la hotte, à température ambiante.
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6. Préparer le milieu d’immortalisation (pour 3 millions de cellules / puits): - milieu complet à 10% SVF, - surnageant EBV d’une culture EBV congelée filtrée puis recongelée - cyclosporine A.
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7. Distribuer le milieu d’immortalisation dans les puits. Après avoir centrifugé les cellules (5min à 1200trs/min), reprendre le culot avec du milieu complet -10% SVF (1ml/3 millions de cell) et distribuer 1ml / puits pré-rempli de milieu d’immortalisation. Placer les plaques à l’étuve : 37 °C, 5% de CO2 et saturation H2O.
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8. 8 à 10 jours après, observer les cellules au microscope et ajouter de milieu complet à 10% SVF (en fonction de la croissance des cellules).
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9. 3 fois par semaine, ajouter du milieu de culture complet 10% SVF en fonction de la croissance.
10. Passer les cultures immortalisées en petites puis grandes flasques avant la mise en ampoules dans un milieu de cryoconservation. La congélation des cellules se fait progressivement au -80°C dans des boîtes adaptées (Nalgen, isopropanol) avant la mise à -150°C.
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